蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，其相對分子量約為29.3 kDa，可切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。Proteinase K應用廣泛，可用于制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶等實驗，而變性劑如SDS（1%）可提高其活性，常用工作濃度為50-100 µg/mL，根據所用緩沖液是否含有SDS、尿素、pH、溫度等因素確定具體的工作濃度。

在37℃，pH 7.5的條件下，每分鐘釋放1 µM酪氨酸所需要的Proteinase K量定義為1個活性單位。